植物病毒病檢測方法

植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種重要病害，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量, 目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑，對發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測就顯得尤為重要。植物病毒學(xué)歷經(jīng)近百年的發(fā)展，植物病毒的檢測方法與手段也在不斷發(fā)展與改進。常用的方法有侵染力測定法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡計數(shù)和分子生物學(xué)法等。

1.4.1侵染力測定法

侵染力測定法是將病毒樣本接種在植物上，根據(jù)侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎(chǔ)。設(shè)計一種新的定量法，如果不經(jīng)過侵染力的驗證，將無法判斷測定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力測定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系統(tǒng)感染率的測定法等。侵染力測定多用粗汁液來接種，為了避免抑制物質(zhì)的作用和使半葉枯斑數(shù)目控制在一定范圍，須用緩沖液稀釋接種物。

局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發(fā)現(xiàn)TMV在心葉煙（Nicotiana glutinosa）接種葉片上引起局部壞死斑點，在一定的病毒濃度范圍內(nèi)，所產(chǎn)生的斑點數(shù)目與病毒濃度成正比例。這一發(fā)現(xiàn)成為病毒侵染性定量測定的基礎(chǔ)（田波，1987）。所有機械傳染的病毒都有可能應(yīng)用局部斑點法，但實際上只有少數(shù)病毒具有可用于定量測定的局部斑寄主。一個待測樣品所形成的斑點數(shù)目除取決于接種物中病毒濃度外，還受試驗植物種類、環(huán)境條件和接種物中是否含有病毒抑制物質(zhì)的影響。

淀粉－碘斑法 當(dāng)所研究的病毒沒有過敏性枯斑寄主時，采用此法。Holmes（1931）發(fā)現(xiàn)TMV接種的煙葉上有時形成明顯的黃化斑塊，但不能用于計數(shù)。將這種接種葉用95％乙醇加熱到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色時，則侵染點處出現(xiàn)淀粉－碘的藍色反應(yīng)。當(dāng)下午采摘葉片，褪色過夜，然后用碘液染色，則侵染點較周圍組織著色淺；當(dāng)采摘葉片前，植株先在黑暗中放幾個小時，再用碘液染色，則侵染點組織著色深。這是由于病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物從光合組織中的運出。淀粉－碘染色的強弱受環(huán)境條件的影響較大，不如局部枯斑法可靠，但在標(biāo)準(zhǔn)化條件下仍可用于侵染性的定量測定。

侵染性滴度法 當(dāng)上述方法都不適用時，可采用侵染性滴度法。即把欲測定樣品用緩沖液稀釋，可用十倍稀釋、成倍稀釋、半倍稀釋或更低稀釋。這種方法的缺點是需用大量實驗植物，但可得到較好的結(jié)果。此方法可用于介體傳染的病毒。

1.4.2血清學(xué)方法

血清學(xué)方法原理是利用抗原抗體的體外特異性結(jié)合檢測植物病毒。主要包括沉淀反應(yīng)、凝聚反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫電鏡（IEM）、放射免疫測定（RIA）、PCR（聚合酶蓮式反應(yīng)）法等。

沉淀反應(yīng) 將可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，當(dāng)兩者的比例合適，并有鹽類存在時，即有沉淀物出現(xiàn)，叫做沉淀反應(yīng)。由于沉淀物主要是由抗體球蛋白所組成，為了保證有足夠的抗體，因此試驗時通常要稀釋抗原，不稀釋抗體。

凝聚反應(yīng) 在微生物細胞懸液中，加入含有特異性抗體的血清，有一定濃度的電解質(zhì)，微生物細胞凝聚成團，叫做凝聚反應(yīng)。分為直接凝聚反應(yīng)與間接凝聚反應(yīng)。由于病毒是可溶性抗原，必須把病毒的抗體先吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒表面，然后與相應(yīng)的抗原結(jié)合反應(yīng)。用于吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、紅細胞等。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked Immunosorbent assay，簡稱ELISA）將酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合,既保持了酶催化反應(yīng)的敏感性,又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性,因而極大的提高了靈敏度；同時它又是一種非均相分析過程,即在反應(yīng)中的每一步之后都有洗滌過程,從而排除了未反應(yīng)物質(zhì)的干擾。自1976年 Voller和Clark等將ELISA應(yīng)用于植物病毒檢測,已形成多種測試方法。常用的方法有有細胞直接法、細胞間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法（Double sandwich method）、雙抗體夾心法（Double antibody sandwich method）測定方式（侯義龍,2000）。這種方法的靈敏度高（可測出1－10納克/毫升的濃度），特異性強，操作簡便，已廣泛應(yīng)用于病毒測定和診斷（盛樹力，1978；馬德芳等,1981）。

免疫電鏡（IEM）是用電鏡檢測抗體特異性結(jié)合于抗原的技術(shù)。Anderson等（1961）和Lafferty與Oeris（1961）發(fā)展了這一方法。其靈敏度高于ELISA。

放射免疫測定（RIA）在抗原抗體反應(yīng)體系中，當(dāng)同位素標(biāo)記抗原（Ag*）與有*的抗體相互作用時，形成有標(biāo)記抗原的復(fù)合物（Ag*Ab）。如下式所示：

Ag*＋Ab Ag*Ab

Ag AgAb

1.4.3 電子顯微鏡計數(shù)

本世紀(jì)三十年代初電子顯微鏡的發(fā)明，使我們能夠觀察到病毒的分子及其細微結(jié)構(gòu)。1940年Kausche和Melcher在電子顯微鏡下觀察到煙草花葉病毒的顆粒。電鏡技術(shù)的建立對病毒學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動作用。

在實際生產(chǎn)過程中，根據(jù)病毒的種類與特點的不同，往往需要把幾種方法結(jié)合起來，就可望建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確、的水體植物病毒的檢測方法。

1.4.4.分子生物學(xué)法

分子生物學(xué)檢測法能夠檢測病毒的侵染能力。此方法靈敏度zui高，能檢測到pg級甚至fg級[1ｆｇ（飛克）=1×10-15ｇ]的病毒,特異性強，檢測速度快，操作簡便，可用于大量樣品的檢測（侯義龍,2000）。目前,常用的分子生物學(xué)方法有核酸分子雜交技術(shù)、dsRNA電泳技術(shù)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等。侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究.[博士學(xué)位論文].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.6

核酸分子雜交技術(shù) 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測—的核酸。待測核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。根據(jù)使用的方法,被檢測核酸可以是提純的（膜上印跡雜交或液相雜交）,也可以在細胞內(nèi)雜交（細胞原位雜交） （盧圣棟，1999）。

雙鏈RNA（dsDNA）電泳技術(shù) ssRNA病毒在植物體內(nèi)增殖,通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的堿基配對dsRNA。DsRNA經(jīng)提純、電泳、染色后,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,并且有些單個病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類（董穎蘋,2001；李鵬翔，2000）。此法已用于一些病毒組（如黃化病毒組、馬鈴薯Y病毒組、番石竹潛病毒組、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組、絨毛煙斑駁病毒組）的分類研究。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù) 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，是近10年來發(fā)展和普及zui迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一（吳乃虎，2000；）。由于它具有強大的擴增能力,并且可與其它分子生物學(xué)方法（如核酸雜交）和免疫學(xué)方法（如ELISA）相結(jié)合應(yīng)用,使其敏感性和特異性都大大增強；因而廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各個學(xué)科（梁國棟，2001）。靈敏度zui高, 儀器價格昂貴，試驗技術(shù)要求高。