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白細胞介素-2(IL-2)生物學活性測定點擊次數:2136 更新時間:2010-07-21

                                           白細胞介素-2(IL-2)生物學活性測定

實驗目的

1.  掌握IL-2生物學活性測定的原理。
  2.  熟悉IL-2生物學活性測定的實驗方法和結果計算。

實驗原理

IL-2是由Th細胞產生的淋巴因子,在淋巴細胞增殖分化過程中起到非常重要的作用。IL-2活性測定基于IL-2能維持IL-2依賴細胞的代謝和存活,促進這類細胞的增殖。細胞在增殖時能量代謝活躍,可產生大量的能量以供合成多種大分子物質和細胞分裂所需,能量代謝的水平與細胞合成DNA水平基本平行,因此,測定細胞能量代謝的水平可以間接地反映細胞增殖情況。

MTT(四甲基偶氮唑鹽)是一種淡黃色的水溶性化合物,活細胞(特別是增殖期的細胞)通過線粒體能量代謝過程中的琥珀酸脫氫酶的作用,使淡黃色的MTT分解產生藍色結晶狀甲臢沉積于細胞內或細胞周圍,且形成甲臢的量與細胞增殖程度呈正比,甲臢經SDS作用后可溶解顯色。溶解液的光密度值與細胞代謝及IL-2活性正相關。

實驗材料

1.  1640培養液(*)、IL-2標準品、待測IL-2樣品、CTLL-2細胞株、MTT溶液(5mg/ml)、10%SDS
  2.  96孔細胞培養板、多頭細胞收集器、微量加樣器、CO2孵箱、酶標儀

實驗方法

1.  制備CTLL-2細胞懸液  取生長旺盛的CTLL-2細胞,用1640培養液將細胞洗3次,用*1640培養液配成2×105/ml細胞懸液。
  2.  稀釋樣品和標準品  將待測樣品和標準IL-2用*1640培養液做一定的倍比稀釋。
  3.  加樣與檢測  向96孔細胞培養板內加入不同稀釋度的樣品和標準品(50μl/孔),每稀釋度3個復孔,并設細胞對照。再向各孔加入50μl細胞懸液,混勻,置5%CO237℃培養36小時,每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6~8小時后,每孔再加10%SDS100μl,充分混勻,37℃孵箱靜放(使甲臢全溶解)。在酶聯儀上選波長570nm測定OD值,將待測樣品的OD值與標準品OD值比較后,求得待測樣品的IL-2活性單位。

結果計算

將各稀釋度的OD值按照樣品zui大增殖OD值的百分比換算成概率單位,可將原來呈S形的曲線轉換成為直線。根據這些點的數據求出各直線的回歸方程。再從回歸方程求出各樣品達50%zui大增殖時的稀釋度,然后按公式求出待測樣品IL-2的活性單位。

注意事項

1.  MTT液要現配現用,避免光照,若有藍色顆粒需過濾后再用。
  2.  生物學測定法敏感性高,特異性強,所測IL-2是具有生物活性的IL-2,而不象免疫學測定法所測定免疫反應性IL-2蛋白,因此測定的條件和要求要嚴格按規程。

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