培養(yǎng)基一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之,MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI- 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng),各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基(SFM)。在開(kāi)始進(jìn)行新的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),如何消除組織培養(yǎng)的污染?可以參考下表所列的條件:
如何消除組織培養(yǎng)的污染?
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi),用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過(guò)濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
① 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
② 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
③ 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
④ 確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3代。
⑤ 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
⑥ 重復(fù)步驟4。
⑦ 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代,確定污染是否以已被消除。
培養(yǎng)基操作建議:
1、商品化的應(yīng)根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)上的要求進(jìn)行儲(chǔ)存。標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有批號(hào),生產(chǎn)日期、有效期及有關(guān)特性。所采用的保藏和運(yùn)輸條件應(yīng)使限度失去水分并提供機(jī)械保護(hù)。
2、配制好之后應(yīng)保存在2~25℃避光的環(huán)境。若保存于非密閉容器中,一般在三周內(nèi)使用;若保存于密閉容器中,一般在一年內(nèi)使用,瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放,防止冷凍破壞凝膠特性。若要長(zhǎng)期保存,瓊脂平板應(yīng)密閉包裝或置于密閉容器中以防止水分流失。
3、保存于密閉容器中,可防止水分流失以延長(zhǎng)保存時(shí)間。
4、滅菌后應(yīng)立即取出,不得儲(chǔ)藏在高壓菌器中,避免影響質(zhì)量。制備好之后應(yīng)保存在2~25℃、避光的環(huán)境。
5、固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應(yīng)在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進(jìn)行,只允許一次,融化后應(yīng)放在45~50℃的水浴中,不得超過(guò)8小時(shí)。